RSS
Wecome to my Blog, enjoy reading :)

Senin, 05 November 2012

Laporan praktikum biokim -- penentuan asam amino dalam sampel



I.       JUDUL PERCOBAAN            : Penentuan Asam Amino dalam Sampel
II.    TANGGAL PERCOBAAN     : 1 Oktober 2012
III. SELESAI  PERCOBAAN        : 1 Oktober 2012
IV. TUJUAN :
Menentukan Asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi kertas.
V.    KAJIAN TEORI          
Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dn pengatur. Protein adlaah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).
Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat bervariasi dari 5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar, protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996).
Struktur asam amino digambarkan sebagai berikut:
                                                           H


H2N               C              COOH

       
                                                           R
                                                                                                (Lehninger, 1995).
Apabila asam amino larut dalam air, gugus karboksilat akan melepaskan ion H+, sedangkan gugus amina akan menerima ion H+, seperti reaksi berikut:
Oleh adanya kedua gugus tersebut asam amino dalam larutan dapat membentuk ion yang bermuatan positif dan juga bermuatan negatif atau disebut juga ion amfoter (zwitterion). Keadaan ion ini sangat tergantung pada pH larutan. Apabila asam amino dalam air ditambah dengan basa, maka asam amino akan terdapat dalam bentuk (I) karena konsentrasi ion OH- yang tinggi mampu mengikat ion-ion H+ pada gugus –NH3+. Sebaliknya bila ditambahkan asam ke dalam larutan asam amino, maka konsentrasi ion H+ yang tinggi mampu berikatan dengan ion –COO- sehingga terbentuk gugus –COOH sehingga asam amino akan terdapat dalam bentuk (II) (Anna Poedjiadi, 1994).
Gugus karboksil pada asam amino dapat dilepas dengan proses dekarboksilasi dan menghasilkan suatu amina. Gugus amino pada asam amino dapat bereaksi dengan asam nitrit dan melepaskan gas nitrogen yang dapat diukur volumenya. Van Slyke menggunakan reaksi ini untuk menentukan gugus amino bebas pada asam amino, peptida maupun protein. (Anna Poedjiadi, 1994).
Struktur protein dapat dibagi menjadi empat bentuk; primer, sekunder, tersier dan kuartener. Susunan linier asam amino dalam protein merupakan struktur primer. Susunan tersebut akan menentukan sifat dasar protein dan bentuk struktur sekunder serta tersier. Bila protein menandung banyak asam amino dengan gugus hidrofobik, daya kelarutannya kurang dalam air dibandingkan dengan protein yang banyak mengandung asam amino dengan gugus hidrofil. (Winarno, 1992).
Protein yang terdapat dalam bahan pangan mudah mengalami perubahan-perubahan, antara lain:
1.      Dapat terdenaturasi oleh perlakuan pemanasan.
2.      Dapat terkoagulasi atau mengendap oleh perlakuan pengasaman.
3.      Dapat mengalami dekomposisi atau pemecahan oleh enzim-enzim proteolitik.
4.      Dapat bereaksi dengan gula reduksi, sehingga menyebabkan terjadinya warna coklat.
Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhdap struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Karena itu denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan atau wiru molekul protein. (Winarno, 1992).
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetrik, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroforesis. Salah satu metode yang paling banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam kromatografinialah kromatografi kertas, kromatogrfi lapis tipis, dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994).
Kromatografi kertas, merupakan salah satu jenis kromatografi partisi, yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan sedikit demi sedikit pada kertas kromatografi pada pada titik tertentu (A) dan kemudian ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan terpisah satu dengan yang lain, dengan penyemprotan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut kan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang terpisah itu. Jarak yang telah ditempuh oleh suatu asam amino tertentu (b), dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh suatu pelarut dari garis awal hingga garis akhir (a) diberi lambang Rf. Harga Rfyaitu b/a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut tertentu. Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui macamnya pada kromatografi kertas seperti yang telah dilakukan di atas, dapat diketahui macam asam amino yang diperiksa. Penentuan macam asam amino dapat pula dilakukan dengan menghitung harga Rf asam amino yang terdapat pada tabel yang ada (Poedjiadi, 1994).
Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan olen Egan Stahl dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini segera populer karena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu analisis cepat dan daya pisah yang cukup baik. Sebagian besar dasar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Konsep “lempeng teori” lebih sukar digambarkan di sini, tetapi jelaslah bahwa pemisahan itu dilakukan oleh keseimbangan bermuatan cuplikan dalam dua fasa, satu diantaranya bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal. Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi, Rf


Jarak yang tempuh pelarut dapat diukur dengan mudah dan jarak tempuh cuplikan diukur pada pusat bercak itu, atau pada titik kerapatan maksimum. Definisi koefisien distribusi K adalah perbandingan dengan kadar senyawa tersebut dalam fasa gerak Cm dan kadar senyawa terlarut dalam fasa diam Cs.
K = Cs / Cm

Fasa diam
Pada semua prosedur kromatografi, kondisi optimum untuk sebuah pemisahan merupakan hasil kecocokan antara fasa diam dan fasa gerak. Dalam KLT, fasa diam harus mudah didapat, keistimewaan KLT adalah lapisan tipis fasa diam dan kemampuan pemisahannya.

Fasa gerak
Pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan silika gel, alumina dan fasa diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom serapan. Jika fasa gerak digunakan sistem pelarut campuran, pada fase diam susunan pelarut itu dapat mengalami perubahan sedikit demi sedikit. Suatu pendekatan yang menarik terhadap penggunaan campuran azeotrop, misalnya metanol – aseton (12 : 88), metanol – benzena (31,7 : 68,3) metanol – sikloheksana – metilasetat (17,8 : 33,6 : 48,6) hal ini mempengaruhi kualitas pemisahan dan kedapat – ulangnya adalah kejenuhan bejana pengembang (Soedjadi, 1988)
Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan senyawa-senyawa organik dan senyawa anorganik. Metode ini berguna untuk fraksionasi campuran kompleks dan pemisahan suatu senyawa-senyawa yang sejenis. Pada tahun 1941, Martin dan Synge mengembangkan kromatografi partisi, sedangkan Gordon menemukan kromatografi kertas. Kromatografi partisi terutama dilakukan pada kromatografi kertas (Khopkar, 1984).
Dalam semua teknik kromatografi, zat terlarut yang akan dipisahkan bermigrasi sepanjang suatu kolom (atau sepanjang seperti dalam kromatografi kertas atau lapisan tipis, padanan fisika dari suatu kolom), dan tentu saja dasar pemisahan terletak dalam berbeda-bedanya laju dari migrasi untuk zat terlarut yang berlainan. Kitadapat membayangkan migrasi dari zat yang terlarut sebagai suatu resultan dua faktor, satu cenderung untuk menggerakkan zat terlarut, dan yang lain untuk menghambatnya (Day dan Underwood. 2002).
Dalam proses Tsweet yang orisinil, kecenderungan zat terlarut untuk teradsorbsi pada fase padat menghambat laju gerakan, sementara kelarutan dalam fase cair yang bergerak cenderung menggerakkan mereka bersama fase itu. Suatu beda sangat kecil antara dua zat terlarut dalam hal keteguhan adsorpsi dan dalam interaksinya dengan zat terlarut yang bergerak menjadi dasar pemisahan bilamolekul-molekul zat terlarut itu berulang-ulang didistribusikan antara kedua fase tersebut sepanjang kolom. Fase stasioner atau diam dapat berupa zat padat atau cairan, sedangkan fase geraknya dapat berupa cairan atau gas (Day dan Underwood. 2002).
TLC digunakan untuk memantau kemajuan reaksi dan untuk mengenali komponen tertentu. Teknik ini sering dilakukan dengan lempengan gelas atau plastik yang dilapisi fase diam. Fase gerak cair adalah pelarut. Campuran yang akan dianalisis diteteskan pada dasar lempengan, dan pelarut akan bergerak naik oleh gaya kapiler (Bresnick, 2004).
Reaksi ninhidrin yang digunakan untuk mendeteksi dan menduga asam amino secara kuantitatif dalam jumlah kecil. Pemanasan dengan ninhidrin berlebih menghasilkan produk berwarna ungu pada semua asam amino yang mempunyai gugus α amino bebas, sedangkan produk yang dihasilkan oleh protein berwarna kuning, karena pada molekul ini terjadi substitusi gugus α amino. Pada kondisi yang sesuai intensits warna yang dihasilkan dapat dipergunakan untuk mengukur asam amino secara kolorimetrik. Metode ini amat sensitif bagi pengukuran konsentrasi asam amino (Lehninger, 1982).

VI. ALAT DAN BAHAN
1.      Alat
a.       Kertas kromatografi
b.      Labu pemisah
c.       Pipa kapiler
d.      Gelas kimia besar
e.       Botol semprot
f.       Oven
g.      Pipet
2.      Bahan
a.       Asam asetat glasial
b.      n-butanol
c.       aquades
d.      larutan asam amino standar
e.       HCl pekat
f.       Larutan sampel

I.                   ANALISIS DAN PEMBAHASAN
 Pada awalnya praktikum Pemisahan Asam Amino dalam Sampel, dibuat larutan pengemulsi (fasa gerak) dengan 25 mL larutan n-Butanol jernih tak berwarna ditambah 6 mL larutan asam asetat glasial jernih tak berwarna.  Lalu ditambahkan akuades 25 mL jernih tak berwarna menghasilkan larutan dengan gelembung dan sedikit keruh. Lalu dijenuhkan kedalam chamber agar eluen jenuh karena eluen mudah menguap maka eluen langsung ditutup dengan kaca berbentuk segiempat.
Larutan Sampel B jernih tak berwarna diteteskan ke kertas kromatografi 4 cm x 12 cm dengan jarak 1 cm (batas bawah). larutan ujung ada pada 0,5 cm dipinggir kertas. Tiap tetesan larutan B harus dikeringkan sebelum tetesan berikutnya diletakkan diatasnya. Diupayakan diameter tetesan tidak lebih dari 0,4 cm dan digunakan pinset. Lalu kertas kromatografi yang sudah ditetesi dengan larutan B, dijenuhkan dengan uap eluen dan dielusi. Lalu dikeluarkan dengan jika eluen mencapai batas atas, dan dikeringkan. Kertas kromatografi disemprotkan larutan ninhidrin dan dimasukkan ke oven selama 5 menit dengan suhu 1000C. Lalu didapatkan jarak noda sampel 1,1 cm dan jarak yang ditempuh pelarut 5,5 cm, sehingga didapatkan nilai Rf :

Larutan Lisin jernih tak berwarna, Sistein jernih tak berwarna dan Tyrosin jernih tak berwarna diteteskan ke kertas kromatografi 4 cm x 12 cm dengan jarak 1 cm (batas bawah). Larutan ujung ada pada 0,5 cm dipinggir kertas. Tiap tetesan Larutan Lisin jernih tak berwarna, Sistein jernih tak berwarna dan Tyrosin jernih tak berwarna harus dikeringkan sebelum tetesan berikutnya diletakkan diatasnya. Diupayakan diameter tetesan tidak lebih dari 0,4 cm dan digunakan pinset. Lalu kertas kromatografi yang sudah ditetesi dengan larutan B, dijenuhkan dengan uap eluen dan dielusi. Lalu dikeluarkan dengan jika eluen mencapai batas atas, dan dikeringkan. Kertas kromatografi disemprotkan larutan ninhidrin dan dimasukkan ke oven selama 5 menit dengan suhu 1000C. Lalu didapatkan jarak noda Lisin 0,3 cm, jarak noda Sistein 1,5 cm, jarak noda Tyrosin 4 cm dan jarak yang ditempuh pelarut 5,8 cm, sehingga didapatkan nilai Rf masing-masing :


Rf sampel sebesar 0,2 mendekati Rf sistein sebesar 0,25 sehingga dapat ditentukan bahwa sampel adalah asam amino Sistein dari peninjuan nilai Rf.

II.         KESIMPULAN
 Dari praktikum “Pemisahan Asam Amino dalam Sampel” dapat disimpulkan bahwa Rf sampel sebesar 0,2 adalah asam amino Sistein yang memiliki Rf = 0,25.

III.      DAFTAR PUSTAKA

Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, Hipokrates, Jakarta

Day, R. A. Jr dan Underwood, A. L., 2002, Analisis Kimia Kualitatif, Edisi keenam, Erlangga, Jakarta

Hart, H., 2003, Kimia Organik: suatu kuliah singkat, Erlangga, Jakarta

Khopkar, S.M., 1984, Konsep Dasar Kimia Analitik, UIP, Jakarta

Lehninger.A.L, 1995. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga, Jakarta

Patong, R., 2007, Penuntun Praktikum Biokimia, Universitas Hasanuddin, Makassar

Poedjadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta

Soedjadi, 1988, Metode pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta

Sudarmadji, S., Haryono, B., Suhardi, 1996. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta.

Tim Dosen Kimia Biokimia. 2012. Penuntun Praktikum Biokimia. Surabaya: Unesa Press

Winarno, F. G., 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Penerbit Gramedia: Jakarta.




IV.       JAWABAN PERTANYAAN
1.      Apa keuntungan dan kerugian dari metode pemisahan dengan kromatografi kertas?
Jawab : keuntungannya antara lain adalah proses pemisahan asam amino dengan menggunakan  kromatografi ini dinilai sangat menghemat waktu, praktis dan tidak mahal. Karena kertas kromatografi yang digunakan adalah kertas kromatografi sederhana . Kerugiannya adalah kurang efektif untuk mendapatakan  nilai Rf , karena kesulitan membaca noda sampel yang diuji. Dan untuk memudahkan membaca noda sampel harus dioven dulu.

2.      Apakah metode kromatiografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif ?
Jawab :
Ya, karena perhitugan Rf tidak hanya sebagai analisa kualitatif, namun juga dapat dianalisa secara kuantitatif dengan membuat perbandinga linear melalui grafik yang dihubungkan dengan sampel satu dengan yang lainnya.

3.      Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?
Jawab : faktor yang mempengaruhi nilai Rf antara lain konsentrasi sampel, jumlah dan cara penotolan sampel, dan kejenuhan chamber atau ekuen yang digunakan.

1 komentar:

Magda Putri mengatakan...

sist gambar nya kok ga ada?

Poskan Komentar

 
Copyright 2009 bLoG.e si boLo..boLo Powered by Blogger
Blogger Templates created by Deluxe Templates
Wordpress by Ezwpthemes